材料样本-低电压透射电镜（TEM）

简介

低电压透射电子显微镜（Low Voltage TEM）采用远低于传统透射电镜（通常为 80 kV～120 kV）的加速电压。由于低能电子与物质的相互作用更强且散射截面更大，该技术能够显著提升轻元素材料及弱散射样品的成像衬度，同时有效降低电子束对敏感样品的辐射损伤，从而实现高分辨率的结构观察与分析。

该测试项目主要应用于细胞、生物组织等样品的内部形貌分析与研究。在测试流程上，需先对样品进行包埋、超薄切片及染色等前处理工序，制备成符合TEM要求的标准样品，随后通过透射电镜对样品的内部组织形貌进行观察。

**1. 关于光镜/分子实验结果与电镜超微结构不一致的问题**

在研究自噬、凋亡、铁死亡或外泌体等生物学过程时，经常会出现光镜（如免疫荧光）或分子实验（如ELISA、Western Blot）观察到强信号，但在透射电镜（TEM）下却无法观察到预期结构，或细胞结构出现严重损坏的情况。其主要原因在于：

光镜/分子水平的变化与超微结构的改变并不完全平行，两者在时间轴上通常不具备同步性。因此，基于分子实验筛选的最强信号时间点取材，并不一定能对应电镜下的形态学峰值。具体原因分析如下：

* **分辨率差异：** 光镜的分辨率较低，部分阳性信号可能并非来自预期的超微结构。例如，某种线粒体标记物在光镜下显示胞质内有大量阳性颗粒，但电镜下并未发现相应结构，经精细分析可能该标记物实际定位在溶酶体中。

* **生理/病理过程的动态性：** 分子水平的表达量增加并不意味着该蛋白已在形态学上发挥作用。部分样本在WB检测中处于阳性最强时段，但电镜下细胞形态依然完好；而部分样本在荧光标记下信号清晰，但此时细胞可能已进入崩解阶段，导致电镜下结构严重受损。

**2. 动物普通组织取材与送样要求**

**取材原则：** 组织应切薄并尽快投入固定液中。

**具体要求：**

1. **固定时效：** 组织离体后，建议在1 min内开始固定。

2. **样本尺寸：** 非灌注组织厚度应控制在4 mm以内。请通过切宽薄片等方式明确组织的位置和层次关系，避免将组织切成过小的颗粒。

3. **操作规范：** 使用锋利薄刀片，沿单一方向切割，严禁来回切割，避免对组织产生挤压或拉扯。

4. **预处理：** 含有食物残渣（如消化道）、大量血液（如心肌）或黏附物（如乳腺）的组织，应先用生理盐水快速漂洗，再投入固定液。

5. **固定液用量：** 确保固定液量充足，固定液与组织的体积比不低于20:1。

6. **保存温度：** 初始固定30 min后，建议将样本置于4 ℃固定液中浸泡。严禁结冰（避免靠近冰箱后壁或使用冰袋直接接触），冬季可选择常温送样。

**容器选择参考（单样本）：**

* 芝麻至绿豆大小（如小鼠肾上腺）：使用1.5 ml EP管。

* 黄豆大小（如小鼠肾脏）：使用5 ml离心管。

* 蚕豆大小的组织片：使用平底25 ml广口瓶。

* **多样本共用容器：** 需适当增大容器体积，确保组织之间无挤压变形。

**3. 培养细胞常规简易取材与送样流程**

1. **细胞收集：** 建议通过刮取方式收集细胞至离心管中，以1500 rpm离心5~10 min（参数可根据经验微调），在不损伤细胞结构的前提下去除培养液成分。

2. **初步固定：** 弃上清液，加入固定液重悬细胞。

3. **离心紧固：** 尽快（1 min内）将细胞悬液转移至1.5 ml尖底EP管中，立即以10,000 r/min离心12 min（此参数适用于一般小型台式离心机，请勿随意更改）。确保细胞离心紧固，离心后细胞团大小约半颗绿豆。

4. **更换固定液：** 静置15 min后，小心弃去上清液，沿管壁缓慢加入室温或4 ℃固定液，避免液体冲击导致细胞团吹散。

5. **保存与运输：** 4 ℃保存或运输。严禁结冰（避免靠近冰箱后壁或使用冰袋直接接触），冬季可选择常温送样。

**注意事项：**

* **适用范围：** 本方法适用于对细胞表面结构无特殊观察要求的动物细胞（如精子、血液、脱落细胞等）及薄壁细菌。

* **禁忌事项：** 观察细胞连接的实验，严禁使用消化法收集细胞。

* **特殊样本：** 不耐受高速离心的样品，请以悬液形式送样，并尽可能装满容器以减少运输震荡。

* **渗透性差样本：** 厚壁真菌等离心紧固后不易渗透的样品，请以悬液形式送样。

**4. 固定液类型及选择**

固定液的选择需根据样本类型确定，并非统一使用：

* **常规样本：** 大多数动物组织和培养细胞使用 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液。

* **神经髓鞘观察：** 使用 3%戊二醛 + Plus辅剂（临用前5 min内混合）。

* **厚壁真菌/细菌芽孢：** 使用 K-T固定液。