生物样本透射电镜_生物样本TEM测试

1、 为什么通过光镜（免疫荧光等）和分子实验（ELISA/WB等）观察到自噬、凋亡等现象，摸索出信号最强的时间点取材，结果电镜下细胞不是结构烂就是没有期待的结构呢？可能的原因有哪些？ 答：光镜和分子水平的变化与超微结构变化不完全平行！是基本上从来都不准确同步的，所以已经做了其他实验后想来看自噬和凋亡的，不一定能看到，铁死亡、外泌体等都有这个问题。 可能的原因有： 1.光镜分辨率不够，看上去阳性的东西，可能根本不在预期结构上。比如，线粒体相关的某标记物，光镜下看到胞质里阳性颗粒很多了，结果电镜下完全没有。精细实验后发现标记的其实是某些溶酶体。 2.生理或病理过程本身的原因。比如有老师来看凋亡，给了荧光照片，胞核标记物超级清楚，结果电镜下细胞很烂。也有给了WB结果，选的阳性最强的时段取材，结果电镜下细胞完好。他们都是同一板细胞分取的。可能分子结果反映的是表达没有，表达了不见得正在发挥作用，形态还是好的。荧光都看到了，那细胞崩裂已经开始，镜下就好不了。 2、 动物普通组织取材、送样 取材原则：切薄并尽快投入固定液；注意下述要求。 1. 请尽快固定。动物组织最好在离体后1 min内开始固定。 2. 非灌注的组织，厚度不超过4 mm，请用恰当方式（比如切宽薄片）体现位置和层次关系。尽量不要事先切成很小的颗粒。 3. 请用锋利薄刀片切组织，朝一个方向划，不要来回切割，不要挤压、拉扯。 4. 含有食物残渣（如消化道）、大量血液（如心肌）或其它黏附物（如乳腺等）的组织，请用生理盐水快速漂洗，再投入固定液。 5. 请保证固定液量充足。固定液和组织的体积比不小于20 : 1。 6. 最初的30 min以后，最好在4 ℃的固定液中浸泡，严禁结冰（太靠近冰箱后壁或冰袋运输都可能使组织结冰。冬季宁可常温送样）。 备注： （1）组织尺寸和容器关系（只装一个的参考标准）： 芝麻到绿豆大小（如小鼠肾上腺）：请用1.5 ml EP管； 黄豆大小（小鼠肾脏）：请用5 ml离心管； 铺展面积类似蚕豆大小的组织片：请用平底的25 ml广口瓶； （2）每个容器含有N个组织时：容器体积要适当增大，组织不要相互挤压变形。 3、 培养细胞常规简易取材、送样？ 1. 最好刮取细胞，收集在离心管中，1500 rpm离心5 ~ 10 min（该参数可按自己的经验调整，目的是不损伤细胞结构的情况下去掉培养液成分）。 2. 弃上清，加入固定液重悬细胞。 3. 细胞悬液尽快（1分钟内，久了离心难以紧固）转移至1.5 ml尖底EP管，立即以10000 r/min离心12 min（该参数适用于一般小型台式离心机，不可随意更改，务必使细胞离紧不散）；离紧后的细胞约半颗绿豆大小，切不可太大。 4. 静置15 min，然后小心弃上清，再沿管壁缓慢加入室温或4 ℃固定液（不可冲击、吹散细胞）。 5. 在4 ℃保存或运输。严禁结冰（太靠近冰箱后壁或冰袋运输都可能使组织结冰。冬季宁可常温送样）。 备注： （1）对细胞表面结构没有特殊观察要求的动物细胞，均可按本法操作，比如精子、血液、脱落细胞等。薄壁细菌也可按本法处理。 （2）观察细胞连接的实验，严禁用消化的方法收集细胞。 （3）不耐受高速离心的样品，请以悬液送样。尽可能装满，以减少运输途中的震荡。 （4）厚壁真菌等离心紧固后不易渗透的样品，也请以悬液送样，要求同上。 4、 固定液类型及介绍？ 大多数动物组织和培养细胞，提供2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液。专门观察神经髓鞘的，提供3%戊二醛＋Plus辅剂（临用前5 min内混合）；观察厚壁真菌或细菌芽孢等，提供K-T固定液。具体根据样本类型选择合适的固定液，并非完全统一。 以下是改写内容： **1. 关于光镜/分子实验结果与电镜超微结构不一致的问题** 在实际研究中，通过光学显微镜（如免疫荧光等）或分子生物学实验（如ELISA、Western Blot等）观察到自噬、凋亡等现象，并据此选取信号最强的时间点进行取材，但在透射电镜（TEM）下却可能观察到细胞结构破坏严重或缺乏预期的超微结构。这种情况在铁死亡、外泌体等研究中也较为常见。 其主要原因在于：光镜/分子水平的变化与超微结构的改变并不完全平行，两者在时间与空间上往往不具备严格的同步性。具体分析如下： （1）分辨率差异：光镜的分辨率有限，荧光阳性信号并不一定对应于预期的超微结构。例如，某种线粒体相关标记物在光镜下显示胞质内有大量阳性颗粒，但电镜下并未发现相应结构，经精细实验证实，该标记物实际上定位在某些溶酶体中。 （2）生理或病理过程的动态特性：分子表达量与形态学改变之间存在时间差。例如，WB结果显示蛋白表达量在某一时间点达到峰值，但此时细胞形态可能依然完好，因为蛋白的表达并不意味着其已发挥生物学功能并引起形态改变。反之，当荧光标记物清晰可见时，细胞可能已经进入崩裂阶段，导致电镜下观察到结构严重受损。 **2. 动物普通组织取材与送样要求** 取材原则：组织应切薄并尽快投入固定液中。具体要求如下： （1）固定时效：组织离体后，建议在1分钟内开始固定。 （2）组织尺寸：非灌注组织厚度应控制在4 mm以内。请通过切宽薄片等方式明确组织的位置和层次关系，尽量避免将组织预先切成细小颗粒。 （3）操作规范：使用锋利薄刀片进行切割，沿单一方向划切，严禁来回切割，避免对组织产生挤压或拉扯。 （4）预处理：含有食物残渣（如消化道）、大量血液（如心肌）或其他黏附物（如乳腺）的组织，在投入固定液前，请先用生理盐水快速漂洗。 （5）固定液用量：确保固定液量充足，固定液与组织的体积比应不低于 20:1。 （6）保存温度：组织在最初固定30分钟后，建议置于4 ℃固定液中浸泡。严禁组织结冰（避免靠近冰箱后壁或使用冰袋直接接触），冬季送样可选择常温运输。 备注： - 容器选择参考（单件组织）： - 芝麻至绿豆大小（如小鼠肾上腺）：使用1.5 ml EP管； - 黄豆大小（如小鼠肾脏）：使用5 ml离心管； - 蚕豆大小的组织片：使用平底25 ml广口瓶。 - 若一个容器中放置多个组织，请相应增大容器体积，确保组织之间无挤压变形。 **3. 培养细胞常规简易取材与送样流程** （1）细胞收集：建议采用刮取法收集细胞至离心管中，以1500 rpm离心5~10 min（该参数可根据实际经验微调，旨在去除培养液成分且不损伤细胞结构）。 （2）固定预处理：弃上清液，加入固定液重悬细胞。 （3）离心沉淀：将细胞悬液尽快（1分钟内）转移至1.5 ml尖底EP管中，立即以10,000 r/min离心12 min（此参数适用于一般小型台式离心机，请勿随意更改，确保细胞离心紧固）。离心后的细胞沉淀体积约半颗绿豆大小，不可过多。 （4）更换固定液：静置15 min后，小心弃去上清液，沿管壁缓慢加入室温或4 ℃固定液，避免液体冲击导致细胞沉淀吹散。 （5）保存与运输：于4 ℃保存或运输。严禁结冰（避免靠近冰箱后壁或使用冰袋直接接触），冬季送样可选择常温运输。 备注： - 适用范围：对细胞表面结构无特殊观察要求的动物细胞（如精子、血液、脱落细胞等）及薄壁细菌均可采用此方法。 - 禁忌事项：观察细胞连接（Cell Junction）的实验，严禁使用消化法收集细胞。 - 特殊样本：不耐受高速离心的样品，请以悬液形式送样，并尽可能装满容器以减少运输震荡。 - 渗透性差样本：厚壁真菌等离心紧固后不易渗透的样品，请以悬液形式送样。 **4. 固定液类型及选择** 根据样本类型选择合适的固定液，并非统一使用。常见方案如下： - 通用方案：大多数动物组织和培养细胞使用 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液。 - 神经髓鞘观察：使用 3%戊二醛 + Plus辅剂（临用前5 min内混合）。 - 厚壁真菌或细菌芽孢：使用 K-T固定液。